基于外泌体的治疗药物：一切已准备就绪

本文节选自来自Codiak BioSciences的研究人员于2020年发表在《Cell & Gene Therapy Insights》的文章“Exosome-based therapeutics: ready for prime time”。详细内容，请参考原文。

简介

有效地将生物活性分子递送到靶细胞是药物开发的关键。对于下一代的治疗方法来说尤其如此，例如基因治疗或基因编辑，其需要将大而复杂的分子和/或遗传信息递送到特定细胞的正确位置。为了了解内源性递送系统(如病毒)的工作原理，人们花费了数十年的时间，研究了许多种类的病毒载体，如慢病毒和基于AAV的治疗方法，这些载体目前正在基因治疗领域带来了革命性的变化。不过，这些以病毒为基础的递送系统面临着许多与其亲代病毒相同的挑战，即它们会诱导强烈的免疫反应，这严重限制了它们的应用，无论是在由于先前的接触而已经存在中和抗体的患者中，还是在第一次治疗接触后无法再次给药的情况。

与人类利用经数百万年的进化来开发基于病毒的载体类似，外泌体代表了一种新的递送方式，有可能彻底改变药物递送。外泌体是纳米级(30-200nm)的细胞外囊泡(EV)，由所有生命类型的细胞释放，在正常生理和疾病病理中发挥作用。这些内源性纳米颗粒由脂质、蛋白质、核酸和碳水化合物组成，具有多种不同的功能，包括维持细胞内稳态和细胞间通讯。近年来外泌体引起了广泛的关注，在过去的十年中，发表的关于外泌体的论文的数量呈指数级增长(仅2019年就有>3000篇)，部分原因在于外泌体在递送不同生物活性大分子物质方面具有令人兴奋的潜力。

尽管人们对外泌体的临床转化很感兴趣，但该领域的发展受到两个主要挑战的限制:

1. 可靠地设计具有明确类药物性质的外泌体;

2. 在足够的规模条件下，可重复地生产GMP外泌体。

在本文中，我们将介绍Codiak BioSciences在解决这两个挑战方面所取得的进展，并介绍基于外泌体的治疗药物现在如何准备好进行临床开发了。

用于特定用途的"精密"工程外泌体

有两种截然不同的方法正被用来开发外泌体疗法:

1. 使用来自生产细胞(通常来自间充质干细胞或干细胞祖细胞)的天然外泌体; 或

2. 具有特异的、药物性质的工程外泌体

虽然这两种方法都有好处的，例如，使用干细胞源性外泌体进行科研性实验时，需要的时间和精力更少，但创建和使用合理且目的性设计的、具有高度定义且可再生属性、同时具有一个已知作用机制(MOA)的外泌体是天然源性外泌体的一个令人信服的替代选择，因为天然源性外泌体通常具有较高的异质性，且作用机制不明确，而前者对于重要新药物的开发来说，也是更加可行的基础。

在过去的几十年中，在开发构建工程外泌体的方面已经做了很多工作，如通过膜靶向序列或外泌体富集蛋白(如GPI 模体、脂质锚、pDisplay 、LAMP2B、CD9、CD63或MFGE8)，将融合蛋白导向外泌体表面或内腔。虽然这些方法有助于我们理解外泌体的生物学和功能，但我们发现，它们通常会导致异质性表达，且对于大多数治疗应用来说，其生物活性水平也不足。由于需要一个强大的外泌体工程平台，我们开始鉴定新的蛋白，以作为“支架”，有效地工程构建具有药物样性质的外泌体。我们很快意识到，要实现这一目标，我们需要一种制备具有足够纯度的外泌体的方法，以确保我们的分析是基于外泌体的，而不是污染性杂质。在外泌体领域，最常用的外泌体纯化方法是基于一系列的超速离心步骤。我们发现，这种方法不足以可重复地分离高纯度的外泌体，因为它同时纯化了许多非外泌体蛋白、膜片段和核酸。只有通过加入密度梯度，我们才能可重复地制备出高纯度的外泌体，我们将其作为新方法开发的参考标准。利用这种高纯度的外泌体以及基于LC-MS的蛋白质组学，我们鉴定出了在外泌体中高度富集的新型支架蛋白。

我们已经鉴定的一个支架，PTGFRN，这是一种I型跨膜糖蛋白，自然存在于外泌体表面；但是通过过表达，我们可以将其拷贝数从单个外泌体40个拷贝增加到5000个以上。通过与PTGFRN的分子融合，我们能够用多种分子修饰外泌体表面，包括抗体片段、细胞因子、报告因子、酶、受体和疫苗抗原。重要的是，通过将靶向配体融合到PTGFRN上，我们能够引导外泌体向性，并且已经成功地在体内和体外靶向了许多细胞类型。

我们的主要项目之一，exoIL-12™，使用PTGFRN修饰带IL-12的外泌体表面，IL-12是一种非常高效的NK和T细胞刺激细胞因子。如此操作后，与重组蛋白相比，通过增加肿瘤的局部驻留时间，以及通过减少全身暴露而降低毒性，我们已经能够显著提高其效价(多个-log级别)。

同样，作为MARKS家族的一员，BASP1能够高效地将融合蛋白引导到外泌体内部(腔内)。利用BASP1已经成功地将多种蛋白质装载到外泌体中，包括报告蛋白、基因组编辑核酸酶、疫苗抗原、亲和配体，甚至是AAV等基因治疗载体。

除了使用分子生物学来工程设计外泌体和生产细胞系，我们还开发了将治疗相关荷载外源性载入外泌体的方法。其中一个例子就是我们的主导项目，exoSTING™，其中外泌体(靶向肿瘤巨噬细胞)载有小分子环二核苷酸(CDN) STING激动剂。STING激动剂已在多个临床前肿瘤模型中显示出有效的肿瘤消退作用，目前正在临床研究中，但游离STING的低肿瘤驻留率和膜渗透性限制了其疗效。我们发现，STING激动剂与外泌体的结合显著改善了PK和PD特性，并使其在体内肿瘤模型中的效力提高了>100倍。我们还在探索将小分子、寡核苷酸(如ASO、siRNA)和肽结合到外泌体中的新方法，如化学偶联或使用疏水模体的膜整合。我们已经非常成功地将偶联胆固醇的ASO分子载入到了外泌体中，能够在每个外泌体中包含数千个ASO分子，并在体外和体内实现高效的mRNA敲除。再加上我们利用靶向模体，将外泌体导向多种细胞类型的能力，ASO整合到靶向特定细胞类型和组织的外泌体中，可以显著扩大ASO和siRNA的治疗效用。

通过细胞工程和外源荷载的结合，我们能够产生具有已知作用机制的分子明确的外泌体。总的来说，我们将这些生成高精度外泌体的方法称为我们的“engEx™”平台，通过该平台，Codiak Biosciences能够快速生成用于探索和治疗应用的定制化外泌体。

生产和分析平台

从公司成立之初，我们就意识到生产将对于我们engEx外泌体的临床转化至关重要。传统上，将先进的生物学研究发展成制造新治疗模式的技术，是一个充满挑战且漫长的工作。科学概念通常起源于学术界，那里只需要极少量的物料用于研究目的。随着该领域的成熟并吸引了工业界的兴趣，而支持临床前和临床工作所需的大量的物料，往往成为一个主要障碍。虽然学术界建立的方法的直接规模扩大通常被视为解决临床物料需求的最快途径，但这些方法通常不是针对可放大性和与常规GMP生产的兼容性而设计的。外泌体生物治疗药物就是这种情况的典型例子。传统上，外泌体的少量制备方法是使用差速离心法 - 一种通过多个离心法步骤而将外泌体从细胞和其它杂质中分离出来的方法。这项技术已被广泛应用，并帮助了外泌体的发现和早期研究。然而，想要使用差速离心法生产大量高质量、高纯度的外泌体，包括用于临床试验或商业化供应的GMP物料，是不切实际的，因此，需要完全不同的技术解决方案。直到最近，外泌体生产的发展一直不快，大多关注的是替代性的特定规模的纯化方法，如体积排阻层析和切向流过滤。用于外泌体生产的大规模细胞培养技术也落后于其它类似的产品。为了应对这些挑战，Codiak BioSciences设计了一个完全整合的外泌体生产平台，包括可放大的上游和下游操作，并有强大的组合分析方法支持。表1总结了我们最初的设计目标。

根据上述指导原则，获得了外泌体生产平台。它的大规模实施标志着外泌体生产的工业化迈出了重要的一步，其路径与重组蛋白和抗体等成熟的分子生物治疗药物领域的最新进展类似。该工艺的上游部分利用悬浮培养生长的永生化人体细胞，以制造所需的engEx结构。细胞培养，使用化学限定培养基，组成型分泌外泌体至上清液中。从生产生物反应器中获得的产品经过一系列过滤和层析步骤，进行下游处理。优化后的纯化工艺得到的结果如下图所示，与我们的参考标准品高度相似。根据engEx结构的不同，纯化和浓缩的外泌体要么直接制剂并小瓶灌装，要么首先载入所需的治疗性载药，然后再制剂并小瓶灌装。该生产平台已经以两种GMP形式进行了实际运行，两者均使用功能性封闭的、一次性使用技术：用于exoSTING的2000L补料分批工艺和用于exoIL-12的500L高密度灌流工艺，生产了大量纯化的外泌体原液。

表1. 外泌体生产技术的目标特点

目标特性	原因和技术方向
高度的可放大性	所需的物料量根据适应症可能有很大的不同：外泌体生物疗法可能既适用于大患者群体，也适用于孤儿适应症；剂量也可能有很大的不同
平台化配置	生产和分析技术应该适用于不同的engEX结构，而不需要进行过多的再开发工作
兼容CDMO基础设施和GMP要求	大多数中小型企业需要在CMO生产毒理学和临床物料。在这种情况下，外泌体生产技术应该与CMO现有的基础设施兼容。生产方法应符合规定的法规要求
高产量和工艺可重复性	生产技术需要使用人类细胞系(减轻免疫反应风险)，同时获得高外泌体产量以及稳定的表达特性。以高密度3D细胞培养(最好是悬浮培养)作为目标
高外泌体纯度	传统的外泌体富集方法常常产生高杂质水平。与这些杂质相关的活性生物分子可能使数据解读、工艺重现性和患者安全性变得复杂化。需要开发可获得高纯度的替代性单元操作
生产工艺中无高风险物料(如血清和动物源性物料)	为了减少对患者安全的风险，工艺污染，细胞培养基、纯化缓冲液和其它材料应不含动物源性成分
稳健的分析方法组合	外泌体的复杂性要求高水平的分析方法以涵盖各种属性。用于GMP批次放行和鉴定的方法需要以一种阶段性适应的方式与监管要求相兼容
合理的生产成本	新的治疗模式，如细胞和基因治疗，往往具有较高的生产成本。在大规模生产技术的设计中应积极考虑成本。

基于MS-蛋白质组学的外泌体纯度与对照品纯度的比较：未完全纯化的物料(左)；来自优化的纯化工艺的物料(右)。

来自GMP 500L灌流生物反应器的高度纯化的外泌体。

高度可重复的上游、下游和分析平台技术的开发带来了巨大的效率收益。这一模式使IND的时间显著加快，在我们最近的经验中，外泌体生物治疗药物的开发时间线并不会过多地落后于其它成熟的分子生物治疗药物形式。展望未来，上述生产和分析技术有望迅速发展，推动外泌体生物疗法不断成长，获得临床成功并最终产业化。

总结

外泌体代表了一种全新的递送工具，它有可能通过靶向特定的细胞类型和组织，而彻底改变药物递送，且有可能克服效力、免疫原性和毒性等阻碍了许多有希望的靶点和方式的问题。外泌体领域现在已经取得了极大的发展，我们相信，外泌体工程和大规模工业制造的进展，已经使基于外泌体治疗的临床开发成为可能。在外泌体领域仍有很多研究有待完成，包括对内源性外泌体功能的更深理解，装载其它”货物”类型的效率的提高，以及在调节外泌体向性方面的持续进展。CodiaK BioSciences已经在所有这些领域取得了有希望的进展。我们相信并希望这些进展将为治疗应用提供新的途径，包括基因组编辑、AAV递送以及新型疫苗平台。

原文：J.Finn, K, Konstantinov, Exosome-based therapeutics: ready for prime time, Cell & Gene Therapy Insights. 2020, 6(4): 597 - 605.